氨基酸定量分析

7.1 簡介

盡管本指南大體上集中在氨基酸分析的初始步驟（重點在水解樣品制備），但本節還是簡要討論了氨基酸分析中更常用的定量方法。在這些示例中，我們獲得了氨基酸分析結果；分析中需要計算原始樣品濃度。在這些示例中，我們假設已使用AccQ•Tag或AccQ•Fluor試劑進行了衍生化處理。

在進行定量之前：

• 驗證是否已正確鑒別所有峰。

• 如果保留時間不匹配，請檢查校正表中的值。

• 檢查所有峰的積分是否正確。

7.2 氨基酸的絕對定量

7.2.1 樣品中蛋白質的濃度

在某些分析中，分析目標只是測定分析樣品的濃度。測定結果通常以摩爾濃度表示，例如µmol/L。色譜結果通常以皮摩爾為單位。要測定濃度，請將色譜軟件報告的氨基酸皮摩爾量除以進樣體積，然后將該值乘以稀釋劑體積，再除以衍生化體積。將該值乘以稀釋因子，然后將單位換算為µmol/L，計算完成。

計算示例：
要確定原始樣品中氨基酸的濃度，請將報告的值用于以下公式：

其中：

pmol AA = 樣品中氨基酸的報告量

Vi = 進樣體積(µL)，通常為1 µL

Vd = 衍生化體積(µL)，通常為10 µL

Vr = 用于復溶樣品的稀釋劑的體積(µL)

Dil. Factor = 稀釋因子

示例：

將初始的100 µL水解蛋白質樣品用內標按1:1稀釋。將10 µL等分試樣進行衍生化處理。進樣體積為1 µL，天冬酰胺(Asn)的報告值為312.5 pmol。

Asn的濃度(µmol/L)為：

7.3 氨基酸的相對定量

水解蛋白質中氨基酸組分的測定涉及樣品中組分摩爾比的計算。

每種純蛋白質對其中包含的每種氨基酸均具有特定的殘基化學計量數。理想情況下，分析結果得到的摩爾比為整數。觀測值接近該理想值的程度受蛋白質或肽的純度、水解條件是否充分，以及氨基酸分析質量的影響。

7.3.1 計算肽組分

示例1（如下表所示）：

1. 將各氨基酸的觀測皮摩爾量（從分析中獲得）列成表格。

2. 檢查并估算各氨基酸的殘基數（估算組分）。注意：觀察到的殘基是每種氨基酸的相對摩爾濃度。將所有觀測皮摩爾值除以豐度最低的氨基酸摩爾量，并四舍五入到最接近的數字。

3. 將所有氨基酸的皮摩爾值和殘基數相加。

4. 將觀測總皮摩爾數除以估算組分的總和來計算每個殘基的平均pmol（pmol/殘基）。

5. 將每個觀測皮摩爾值除以pmol/殘基值以確定觀測組分。

平均pmol/殘基

警告：對于較大的蛋白質，由于需要更高的精度，因此更難以估算殘基數。

警告：某些氨基酸的水解回收率可能會變化（Ser、Tor、Tyr和Met會降解；Val和Ile鍵可能難以斷裂）。

注：為了在這類情況下改善定量，建議進行時程研究。通常，可將樣品水解24 h、48 h和72 h（或96 h）；不穩定的氨基酸值可通過外推回零時間來確定，而Ile和Val的值可從時間最長的水解中獲得。

示例2：
在一些情況下，如前所述，可以使用摩爾百分比（每100個蛋白質殘基中各氨基酸的殘基數）計算結果。測定方法如下：

7.3.2 估算蛋白質分子量

如果可以估算蛋白質的分子量，則可以使用兩種方法來計算大致組分：

7.3.2.1 基于氨基酸大小和總產物量計算組分

1. 估算的樣品分子量(MW)。

2. 將氨基酸的總產物量相加(pmol)。

3. 將分子量除以110（氨基酸的平均分子量）。注：由此可計算得出非常接近總鏈長或氨基酸總量的值。

4. 將總產物量除以鏈長（等于進樣的摩爾量）。

5. 將每種氨基酸的量除以進樣的摩爾量（等于每摩爾的殘基數）。檢查該值與整數量的偏差。

6. 稍微向上或向下調整除數（進樣的摩爾量），盡可能減小與整數值（步驟5中獲得）的偏差。可利用計算機電子表格程序或專屬定制的氨基酸軟件找出最小偏差，簡化該步驟。

7. 請記住，由于水解回收率低，不穩定的氨基酸和穩定鍵合形成物的值可能會顯著偏離整數值。

7.3.2.2 基于歸一化至單個氨基酸計算組分

這種替代方法需要有關樣品的更多知識。

1. 在分析中選擇滿足以下兩項標準的氨基酸：

• 在水解和衍生化時產率高（例如，Asp、Glu、His、Arg、Ala、Pro、Leu、Phe、Lys）。不建議選擇Gly，因為它是一種常見的背景污染物；

• 每摩爾樣品可能僅含有幾個殘基（基于估算的樣品分子量和氨基酸產量）。這些信息可以從其他方法中獲得，例如溴化氰水解，溴化氰可在蛋氨酸處選擇性地切割完整的多肽鏈。

2. 基于這些信息，為該氨基酸選擇一個整數值。

3. 將所選氨基酸的產量除以所選整數值，即可得到估算的進樣摩爾量。

4. 按照第7.3.2.1節步驟5和6操作。

5. 檢查得出的值（一個小于和一個大于所選整數的值），確定它們與整數的偏差是否減小。

7.3.2.3 計算肽/蛋白質濃度

將每個氨基酸的皮摩爾數與其相應的分子量的乘積相加，計算原始樣品中肽或蛋白質的濃度。

使用第7.3.1節表格中引用的示例，開始按照以下方法計算：

計算示例：

對于樣品中的Asp（天冬酰胺）：分子量為133.10 g/moL的氨基酸的觀測含量為220皮摩爾，如下所示：

對于其他所需的氨基酸，該計算方法也適用。下表顯示了計算得出的每種氨基酸的皮克數值，右下角顯示了樣品中進樣的蛋白質的皮克數值總和。

注入蛋白質的皮克數總和

7.4 飼料中氨基酸的定量分析

在食品和飼料分析中，上述計算值也適用。然而，對大多數飼料分析而言，更重要的信息是一些特定的、限制動物生長的氨基酸（例如蛋氨酸和半胱氨酸）含量。最常引起關注的值是樣品中的氨基酸含量（重量百分比）。

7.4.1 計算食品/飼料中氨基酸的重量百分比

要計算氨基酸的重量百分比：

計算示例：

步驟1：將報告的氨基酸摩爾濃度換算為報告的含量(g/mL)。

報告的含量值(pmol/µL)須乘以殘基分子量(gm/mol)和換算系數。

步驟2：將報告的每種氨基酸的含量換算為重量。

然后將報告的含量(g/mol)乘以稀釋因子。再將結果除以樣品的重量并乘以100，即可換算為重量百分比。

計算示例：

其中：

    含量 = 氨基酸的含量，g/mL

    稀釋因子 = 樣品稀釋因子

步驟3：將報告的每種氨基酸的含量換算為重量百分比。

樣品重量以mg為單位

7.4.2 官方AOAC方法994.12"飼料中的氨基酸"：計算樣品中氨基酸的重量百分比

該方法需要使用內標。

計算示例：

步驟1：計算每種氨基酸的響應因子(RFaa)。

將內標的峰面積乘以氨基酸的重量(mg)。然后將計算值除以氨基酸峰面積與內標重量相乘的值。

其中：

    RF_aa = 氨基酸的響應因子

    P_n = 內標的峰面積

    P_aa = 樣品中氨基酸的峰面積

    W_aa = 氨基酸重量(mg)

    W_n = 內標重量(mg)

步驟2：計算內標(IS)因子。

步驟3：確定氨基酸的重量百分比。

開始計算含量百分比：將氨基酸峰面積乘以計算出的響應因子，然后將該值乘以內標因子。將結果除以內標峰面積和分析樣品重量的被乘數。然后將結果值換算為百分比。

其中：

    P_aa = 氨基酸峰面積

    P_n = 內標峰面積

    RF_aa = 計算出的響應因子

    IS = 計算出的內標因子

示例：

對于飼料樣品中的氨基酸，已確定以下值：

    氨基酸重量(W_aa) = 0.5 mg

    氨基酸峰面積(P_aa) = 100,000

    內標峰面積(P_n) = 110,000

    內標重量(W_n) = 0.5 mg

    待測樣品的重量(W_s) = 10 mg

步驟1：計算響應因子(RF_aa)：

步驟2：計算內標因子(IS)：

0.5 mg × 2 × 10-2 = 0.05

步驟3：通過計算出的兩個值，即可確定氨基酸的百分比：

在飼料中，目標氨基酸的重量百分比為0.9%。