氨基酸水解和分析綜合指南

簡(jiǎn)介

  在食品、飼料和生物治療產(chǎn)品的研究、開(kāi)發(fā)與商業(yè)化中準(zhǔn)確分離、鑒定和定量分析氨基酸的任務(wù)具有挑戰(zhàn)性。這些應(yīng)用的共同點(diǎn)在于需要充分的樣品水解，這是分析結(jié)合氨基酸（例如肽和蛋白質(zhì)）的工作流程中重要的第一步。通過(guò)水解可以分析游離氨基酸，使用離子交換或反相色譜法將這些氨基酸分離。

 鑒于樣品制備工作流程中存在挑戰(zhàn)，本文檔旨在為樣品水解提供有用的指南。本文檔中包含的材料僅作為此水解過(guò)程的入門(mén)指引。根據(jù)樣品類型及其復(fù)雜性不同，可能需要對(duì)所述水解方法進(jìn)行修改。如需有關(guān)水解或特定程序的更多信息或故障排除提示，您應(yīng)當(dāng)聯(lián)系水解儀器的制造商或相應(yīng)的機(jī)構(gòu)- 美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)。沃特世無(wú)法提供有關(guān)特定樣品類型的指導(dǎo)。

 為通過(guò)HPLC或UPLC分析水解后的樣品（游離氨基酸），沃特世提供了許多使用柱前衍生化的解決方案，以便可以通過(guò)光學(xué)檢測(cè)來(lái)分析氨基酸。由于這是工作流程的一部分，因此我們將簡(jiǎn)要介紹沃特世HPLC (AccQ•Tag)方法和UPLC氨基酸分析(AccQ•Tag Ultra)解決方案。本文檔不包含有關(guān)Waters Pico-Tag（異硫氰酸苯酯柱前衍生化試劑）氨基酸分析方法的信息。盡管Pico-Tag方法仍然可用，但基于AccQ•Tag的方法具有顯著性能優(yōu)勢(shì)，建議將后者用于新應(yīng)用。

注：本文檔重點(diǎn)講述純化后的蛋白質(zhì)/肽、食品和飼料的水解以及氨基酸分析。其并非專門(mén)針對(duì)尿液、血漿、全腸外營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品或細(xì)胞培養(yǎng)基樣品中的氨基酸分析。

通用分析指南和建議

 鑒于氨基酸在環(huán)境中無(wú)處不在，背景污染很容易導(dǎo)致在所需的樣品分析中出現(xiàn)20 pmol或更多的某些氨基酸，特別是絲氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)。可采取特殊預(yù)防措施來(lái)減少背景氨基酸的量。或者，如果水解足夠的樣品以提供每種氨基酸至少200 pmol的量，則可以將背景污染的影響程度限制在10%以下。無(wú)論采用何種方式，為了利用現(xiàn)代衍生化技術(shù)和色譜系統(tǒng)的靈敏度（檢測(cè)限可達(dá)1 pmol或更低），潔凈度和良好的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)都至關(guān)重要。污染源無(wú)處不在；常見(jiàn)的污染源包括臟污的玻璃器皿、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物、空氣中的灰塵、指紋和滑石粉。

 盡管沒(méi)有一套完美的系統(tǒng)可以改善低含量氨基酸分析的整體質(zhì)量，但以下考慮要點(diǎn)和實(shí)踐將會(huì)有所幫助：

• 在500 °C下過(guò)夜熱解所有6 × 50 mm水解管（P/N：WAT007571），以提供盡可能潔凈的玻璃。從冷卻的爐中取出水解管后，用鋁箔（經(jīng)丙酮清潔）將其覆蓋并儲(chǔ)存于有遮蓋的區(qū)域內(nèi)。

• 請(qǐng)注意，移液器、一次性吸頭、注射器和該程序中使用的其他附件都可能引入污染物。

• 在水解之前，使用干凈的無(wú)粉手套和干凈的夾鉗來(lái)執(zhí)行所有處理步驟。外科口罩可能適用。

• 始終使用新鮮試劑。每種試劑都可能成為污染源。最佳做法是將剛打開(kāi)的試劑分裝到更小、更干凈的容器中。

• 每周使用對(duì)照空白衍生化檢查試劑質(zhì)量。

• 盡可能使用氣相水解程序。純度不足的鹽酸可能是水解不可靠的根源。我們一致認(rèn)為使用恒沸鹽酸十分合適。高純度、試劑級(jí)濃鹽酸可能不夠潔凈，而且其包含的氯含量明顯高于恒沸級(jí)。

• 造成任何背景污染的測(cè)試用水和緩沖液成分用作對(duì)照樣品。例如，實(shí)驗(yàn)室用的雙蒸水通常會(huì)產(chǎn)生不可接受的氨基酸水平。為獲得高水質(zhì)，強(qiáng)烈建議使用純化系統(tǒng)（18.2mΩ-cm水）。

• 合適的水解對(duì)照空白是與樣品經(jīng)過(guò)完全相同的處理的樣品管。其中包括水解步驟。